สิ่งที่ทำให้เปปไทด์เสื่อมสภาพจริงๆ
ทำไมผงแห้งแบบ lyophilised และสารละลายที่ผสมใหม่จึงเป็นปัญหาเสถียรภาพที่แตกต่างกัน เคมีที่ทำลายเปปไทด์ และทางเลือกในการจัดการใดที่มีความสำคัญอย่างวัดผลได้
คำแนะนำในการเก็บรักษาเปปไทด์สำหรับการวิจัยแพร่หลายเป็นชุดของกฎที่ไม่มีเหตุผลอธิบายแนบมา: เก็บให้เย็น อย่าเขย่า ใช้ภายในหนึ่งเดือน กฎเหล่านี้ถูกต้องโดยทั่วไป ซึ่งเป็นเหตุผลที่มันคงอยู่ แต่เมื่อระบุโดยไม่มีกลไกแล้วก็ไม่สามารถนำไปใช้กับสถานการณ์ที่ไม่มีใครเขียนกฎไว้ได้
คู่มือนี้ครอบคลุมสิ่งที่กำลังเกิดขึ้นทางกายภาพกับเปปไทด์ในขวด สภาวะใดที่เร่งมัน และช่วงเสถียรภาพสัญญาอะไรและไม่สัญญาอะไร
แห้งและละลายเป็นปัญหาที่แตกต่างกัน
เกือบทุกเส้นทางการเสื่อมสภาพที่สำคัญสำหรับเปปไทด์ต้องการน้ำ hydrolysis ต้องการมันเป็นสารตั้งต้น deamidation ดำเนินการผ่านสารตัวกลางที่มีน้ำ aggregation ต้องการโมเลกุลที่เคลื่อนที่ได้ในสารละลายมากพอที่จะพบกัน การกำจัดน้ำไม่เพียงแต่ทำให้สิ่งเหล่านี้ช้าลง แต่ยังกำจัดสภาวะที่สิ่งเหล่านี้ส่วนใหญ่ต้องการ
นั่นคือสิ่งที่ lyophilisation มีไว้สำหรับ การแช่แข็งแห้งทิ้งของแข็งแบบอสัณฐานแห้งไว้ซึ่งเปปไทด์ถูกขังด้วยจลนศาสตร์และไม่ค่อยมีปฏิกิริยาเป็นส่วนใหญ่ มันคือเหตุผลที่วัสดุ lyophilised ทนต่ออุณหภูมิปกติในการขนส่ง และเป็นเหตุผลที่มันเป็นรูปแบบที่เปปไทด์สำหรับการวิจัยถูกจัดส่งมา
การผสมใหม่ย้อนกลับทั้งหมดนั้นในขั้นตอนเดียว ในขณะที่น้ำ bacteriostatic เข้าสู่ขวด ทุกเส้นทางที่ขึ้นกับน้ำพร้อมใช้งานอีกครั้ง และวัสดุเคลื่อนจากปัญหาการเก็บรักษาที่วัดเป็นปีไปสู่ปัญหาที่วัดเป็นวันหรือสัปดาห์
Lyophilised
มีเสถียรภาพเพียงพอสำหรับการจัดส่งในอุณหภูมิปกติและการเก็บรักษาแช่แข็งระยะยาว ปัจจัยจำกัดคือการรั่วซึมของความชื้นผ่านจุกที่ถูกทำลายและเมื่อเวลาผ่านไปนานคือ oxidation
ในสารละลาย
เส้นทาง hydrolytic และ conformational ทั้งหมดทำงานอยู่ การทำความเย็นที่ 2-8 องศาเซลเซียสทำให้พวกมันช้าลง มันไม่หยุดพวกมัน ช่วงที่ใช้งานได้เป็นเฉพาะสารประกอบและระบุไว้ในแต่ละหน้าผลิตภัณฑ์
เส้นทางสี่ทางที่ทำลายเปปไทด์
การเสื่อมสภาพไม่ใช่กระบวนการเดียว การรู้ว่าข้อผิดพลาดในการจัดการใดเร่งอันใดอธิบายว่าทำไมคำแนะนำมาตรฐานจึงมีรูปแบบเช่นนั้น
Hydrolysis
น้ำตัดโซ่หลักเปปไทด์ ง่ายที่สุดที่คู่กรดอะมิโนเฉพาะและที่ค่า pH สุดขั้ว นี่คือเส้นทางหลักสำหรับเปปไทด์ในสารละลายและเป็นเหตุผลที่ขวดที่ผสมใหม่มีช่วงจำกัดเลย
Oxidation
กรดอะมิโน methionine, cysteine และ tryptophan ทำปฏิกิริยากับออกซิเจนที่ละลาย เร่งด้วยแสงและด้วยไอออนโลหะร่องรอย ลำดับที่มีกรดอะมิโนเหล่านั้นมีความเสี่ยงมากกว่า ซึ่งเป็นเหตุผลหนึ่งที่ช่วงเสถียรภาพแตกต่างกันระหว่างสารประกอบที่ดูคล้ายกันไม่เช่นนั้น
Deamidation
กรดอะมิโน asparagine และ glutamine แปลงเป็น aspartate และ glutamate เปลี่ยนประเภทของโมเลกุลโดยไม่ทำลายโซ่ ผลลัพธ์ยังสามารถปรากฏเป็นพีคบน chromatogram ในขณะที่ไม่ใช่สารประกอบที่ตั้งใจไว้อีกต่อไป
Aggregation และ adsorption
โมเลกุลเปปไทด์เชื่อมโยงกัน หรือติดกับพื้นผิวแก้วและพลาสติก ทั้งสองไม่ใช่ปฏิกิริยาเคมี แต่ทั้งคู่กำจัดเปปไทด์ออกจากสารละลาย การกวนขับเคลื่อนทั้งสองโดยการเปิดเผยโมเลกุลต่อรอยต่ออากาศ-ของเหลวซ้ำๆ
สิ่งที่เปลี่ยนอัตราอย่างวัดผลได้
กฎการจัดการสอดคล้องกับกลไกข้างต้น แต่ละอย่างต่อไปนี้คุ้มค่าที่จะทำเพราะเส้นทางเฉพาะที่มันทำให้ช้าลง
- 01
อุณหภูมิ
อัตราปฏิกิริยาลดลงอย่างชันเมื่ออุณหภูมิลดลง ซึ่งเป็นพื้นฐานทั้งหมดสำหรับการทำความเย็นขวดที่ผสมใหม่และการแช่แข็งสต็อก lyophilised นี่ยังเป็นเหตุผลที่ขวดที่ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องระหว่างการดูดสูญเสียช่วงของมันมากกว่าที่เวลาที่ผ่านไปบ่งชี้
- 02
แสง
แสงอัลตราไวโอเลตและแสงที่มองเห็นขับเคลื่อน oxidation ของกรดอะมิโนอะโรมาติกและที่มีกำมะถัน ขวดถูกเก็บไว้ในกล่องแทนที่จะอยู่บนชั้นวางเปิดด้วยเหตุผลนี้เพียงอย่างเดียว
- 03
การกวน
การเขย่าบังคับให้สารละลายผ่านรอยต่ออากาศ-ของเหลวซ้ำๆ ซึ่งโมเลกุลเปปไทด์คลี่ออกและรวมตัว การหมุนบรรลุการละลายโดยไม่สร้างรอยต่อนั้น ซึ่งเป็นเหตุผลที่คำสั่งคือหมุนเสมอและไม่เคยเขย่า
- 04
การแช่แข็ง-ละลายหลายรอบ
แต่ละรอบทำให้ตัวละลายเข้มข้นที่หน้าน้ำแข็งที่เคลื่อนไปและสร้างความเครียดทางกลต่อเปปไทด์ สารละลายที่แช่แข็งและละลายหลายครั้งสามารถสูญเสียมากกว่าสารที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิคงที่เป็นระยะเวลารวมเท่ากัน
- 05
การสัมผัสกับจุกและเข็ม
การเจาะจุกขวดซ้ำๆ แนะนำเส้นทางสำหรับทั้งการรั่วซึมของจุลินทรีย์และออกซิเจน นี่คือสิ่งที่สารกันบูด bacteriostatic จัดการ และสิ่งที่มันไม่ทำ
ทำไมการเลือกน้ำจึงสำคัญ
ตัวเจือจางไม่เฉื่อย สิ่งที่ละลายในมันกำหนดว่าขวดสามารถดูดได้มากกว่าหนึ่งครั้งหรือไม่ และในบางกรณีว่าเปปไทด์ละลายเลยหรือไม่
Bacteriostatic water
มี benzyl alcohol ประมาณ 0.9% ซึ่งยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ สารกันบูดนั้นคือสิ่งที่ทำให้ขวดดูดหลายครั้งเป็นไปได้ และมันคือเหตุผลที่มันเป็นตัวเจือจางมาตรฐานสำหรับเปปไทด์สำหรับการวิจัยที่จัดหาในปริมาณที่ตั้งใจไว้สำหรับมากกว่าหนึ่งครั้งดูด
Sterile water
ปลอดเชื้อ ณ จุดการผลิต ไม่มีสารกันบูด ขวดที่ผสมใหม่ด้วยมันไม่มีการป้องกันต่อสิ่งมีชีวิตที่แนะนำเมื่อเจาะครั้งแรก ดังนั้นมันจึงเป็นการเตรียมการใช้ครั้งเดียว
สารละลาย acetic acid
เปปไทด์บางตัวละลายได้ไม่ดีที่ pH เป็นกลางและถูกจัดหาด้วยตัวเจือจาง acetic acid เจือจางแทน นี่เป็นมาตรการความสามารถในการละลาย ไม่ใช่มาตรการสารกันบูด และมันใช้เฉพาะที่ผลิตภัณฑ์ระบุมัน
สิ่งที่สารกันบูดไม่ทำ
Bacteriostatic หมายความว่ามันยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ มันไม่ทำให้สารละลายที่ปนเปื้อนปลอดเชื้อ และมันไม่มีผลเลยต่อเส้นทางการเสื่อมสภาพทางเคมีข้างต้น — ขวดสามารถมีความถูกต้องทางจุลชีววิทยาและทางเคมีผ่านพ้นการใช้งานได้
ทำไมเปปไทด์สำหรับการวิจัยจึงส่งโดยไม่ต้องทำความเย็น
คำถามที่เกิดขึ้นซ้ำๆ คือว่าเปปไทด์ที่มาถึงที่อุณหภูมิปกติถูกทำลายในการขนส่งหรือไม่ สำหรับวัสดุ lyophilised คำตอบคือการจัดส่งแบบอุณหภูมิปกติเป็นสภาวะที่คาดหวังมากกว่าการประนีประนอม และเหตุผลคือเหตุผลที่คู่มือนี้เปิดด้วย: เปปไทด์แห้งขาดน้ำที่เส้นทางการเสื่อมสภาพส่วนใหญ่ต้องการ
นี่คือเหตุผลที่วัสดุถูกจัดส่งในสถานะ lyophilised และผสมใหม่ที่ปลายทางแทนที่จะจัดส่งในสารละลาย ช่วงการขนส่งถูกใช้ในรูปแบบที่ทนต่อมัน และนาฬิกาบนช่วงที่สั้นกว่าที่ไวต่ออุณหภูมิเริ่มต้นเฉพาะเมื่อน้ำถูกเพิ่มเข้ามา
ไม่มีสิ่งใดที่ทำให้สถานะ lyophilised ทำลายไม่ได้ ความร้อนเป็นเวลานานยังสำคัญ และขวดที่ซีลถูกทำลายได้รับความชื้นเข้ามาไม่ว่าอุณหภูมิที่มันเดินทางมาเท่าไร การตรวจสอบเมื่อมาถึงคือสภาพทางกายภาพของขวดและจุก ไม่ใช่อุณหภูมิของพัสดุ
ช่วงเสถียรภาพกำลังอ้างอะไร
ช่วงที่ระบุเป็นข้อความเกี่ยวกับอัตราภายใต้สภาวะที่ระบุ ไม่ใช่สวิตช์ วัสดุไม่กลายเป็นใช้งานไม่ได้เมื่อสิ้นสุดและมีประสิทธิภาพเต็มที่จนถึงตอนนั้น มันลดลงอย่างต่อเนื่อง และช่วงทำเครื่องหมายที่การลดลงหยุดการยอมรับได้สำหรับวัตถุประสงค์
ผลที่ตามมาสองประการ ขวดที่เก็บไว้ในอุณหภูมิที่อุ่นกว่าเงื่อนไขที่ระบุไว้จะใช้ช่วงเวลาที่กำหนดไว้เร็วกว่าที่ปฏิทินแสดง และช่วงเวลาที่อ้างถึงโดยไม่มีอุณหภูมิที่ระบุไว้ด้วยนั้นไม่ใช่ข้อกล่าวอ้างที่สามารถประเมินได้เลย
ช่วงเวลามีความเฉพาะเจาะจงต่อสารประกอบเนื่องจากกลไกมีความเฉพาะเจาะจงต่อลำดับ peptide ที่ไม่มี methionine, cysteine หรือ tryptophan จะไม่มีเส้นทางการเกิด oxidation ที่มีนัยสำคัญ และ peptide ที่ไม่มี asparagine หรือ glutamine จะไม่เกิด deamidation ตัวเลขสำหรับสารประกอบแต่ละชนิดระบุไว้ในหน้าผลิตภัณฑ์ของตัวเองแทนที่จะสรุปไว้ที่นี่
คำถามที่พบบ่อย
- peptide ที่มาถึงในอุณหภูมิห้องหมายความว่าเสื่อมสภาพแล้วหรือไม่
ไม่ใช่สำหรับวัสดุที่ผ่านกระบวนการ lyophilisation ซึ่งจัดส่งในสภาพแห้งเพราะสภาพแห้งทนต่อการขนส่งในอุณหภูมิแวดล้อมได้ เส้นทางการเสื่อมสภาพส่วนใหญ่ต้องการน้ำ และ freeze-drying จะเอาน้ำออก การตรวจสอบที่มีความหมายเมื่อได้รับคือขวดและจุกปิดมีสภาพสมบูรณ์ทางกายภาพหรือไม่ เนื่องจากการปิดผลที่บุบสลายจะให้ความชื้นเข้าไปไม่ว่าพัสดุจะเดินทางในอุณหภูมิใด
- เหตุใดการหมุนขวดจึงสำคัญมากกว่าที่ฟังดูเหมือน
การเขย่าซ้ำๆ จะผลักให้สารละลายผ่านรอยต่อระหว่างอากาศและของเหลว ซึ่งโมเลกุล peptide จะคลี่ตัวและรวมตัวกัน aggregation จะเอา peptide ออกจากสารละลายโดยไม่มีปฏิกิริยาเคมีใดๆ เกิดขึ้น การหมุนจะละลายผงโดยไม่สร้างรอยต่อนั้น ซึ่งเป็นเหตุผลที่ความแตกต่างนี้ถูกสร้างขึ้นอย่างสม่ำเสมอในคำแนะนำการจัดการ
- bacteriostatic water ป้องกันไม่ให้ peptide สลายตัวทางเคมีหรือไม่
ไม่ bacteriostatic water มี benzyl alcohol ซึ่งยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์และเป็นสิ่งที่ทำให้สามารถดูดจากขวดได้มากกว่าหนึ่งครั้ง มันไม่มีผลต่อ hydrolysis, oxidation หรือ deamidation ดังนั้นสารละลายสามารถคงสภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์ได้ในขณะที่ peptide ในนั้นได้เสื่อมสภาพไปไกลเกินกว่าความเป็นประโยชน์แล้ว
- เหตุใดช่วงเวลาความคงตัวจึงแตกต่างกันระหว่าง peptides ที่ดูคล้ายกัน
เพราะเส้นทางการเสื่อมสภาพมีความเฉพาะเจาะจงต่อลำดับ oxidation ต้องการ methionine, cysteine หรือ tryptophan residues; deamidation ต้องการ asparagine หรือ glutamine peptide ที่ขาด residues เหล่านั้นจะไม่สามารถเข้าถึงเส้นทางที่เกี่ยวข้องได้อย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นสารประกอบสองตัวที่มีขนาดและการใช้งานคล้ายกันจึงสามารถมีช่วงเวลาที่แตกต่างกันมาก
- การแช่แข็งและละลายซ้ำๆ แย่กว่าการเก็บในตู้เย็นแบบต่อเนื่องหรือไม่
โดยทั่วไปใช่สำหรับวัสดุที่อยู่ในสารละลายแล้ว แต่ละรอบการแช่แข็ง-ละลายจะเพิ่มความเข้มข้นของตัวละลายที่ด้านหน้าน้ำแข็งที่เคลื่อนตัวและกระทำแรงกดทางกลต่อ peptide ดังนั้นหลายรอบอาจสิ้นเปลืองมากกว่าการเก็บสารละลายเดียวกันไว้ที่อุณหภูมิเย็นที่คงที่เป็นเวลารวมเท่ากัน
- certificate of analysis สามารถยืนยันได้หรือไม่ว่าขวดยังอยู่ในช่วงเวลาความคงตัว
ไม่ได้ certificate รายงานสิ่งที่ห้องปฏิบัติการหนึ่งวัดได้จากตัวอย่างหนึ่งในวันที่ระบุไว้ และไม่ได้พูดถึงวิธีการจัดเก็บหรือจัดการวัสดุหลังจากนั้น ความบริสุทธิ์ ณ จุดที่ทดสอบและความคงตัวในการจัดเก็บเป็นคำถามที่แยกกัน และไม่ใช่หลักฐานซึ่งกันและกัน